新人教版生物选修1课题3《血红蛋白的提取和分离》word教案

课题:血红蛋白的提取和分离 教学目标: 1、尝试从血液中提取和分离血红蛋白 2、了解色谱法、电泳法等分离生物大分子的基本原理 教学重点:凝胶色谱法的原理和方法 教学难点:样品的预处理;色谱柱填料的处理和色谱柱的装填 教学过程: (一)引入新课 蛋白质是生命活动的主要承担者,是细胞内含量最高的有机化合物。对蛋白质的研究有助于人 们对生命过程的认识和理解。所以需要从细胞中提取蛋白质进行研究。怎样提取蛋白质呢? (二)进行新课 1.基础知识 蛋白质的物化理性质:形状、大小、电荷性质和多少、溶解度、吸附性质、亲和力等千差万 别,由此提取和分离各种蛋白质。 1.1 凝胶色谱法(分配色谱法): (1)原理:(见课件图) 分子量大的分子通过多孔凝胶颗粒的间隙,路程短,流动快;分子 量小的分子穿过多孔凝胶颗粒内部,路程长,流动慢。 (2)凝胶材料:多孔性,多糖类化合物,如葡聚糖、琼脂糖。 [ (3)分离过程: 混合物上柱→洗脱→大分子流动快、小分子流动慢→收集大分子→收集小分子 *洗脱:从色谱柱上端不断注入缓冲液,促使蛋白质分子的差速流动。 1.2 缓冲溶液 (1)原理:由弱酸和相应的强碱弱酸盐组成(如 H2CO3-NaHCO3,HC-NaC,NaH2PO4/Na2HPO4 等),调节酸和盐的用量,可配制不同 pH 的缓冲液。 (2)缓冲液作用:抵制外界酸、碱对溶液 pH 的干扰而保持 pH 稳定。 1.3 凝胶电泳法: (1)原理:不同蛋白质的带电性质、电量、形状和大小不同,在电场中受到的作用力大小、 方向、阻力不同,导致不同蛋白质在电场中的运动方向和运动速度不同 [思考]阅读投影补充材料后,填写下表: 决定运动 形成库 形成 决定运动 方向 仑力 阻力 速率 电荷 √ 性质 电荷 √ √ 量 分子 √ √ 形状 分子 √ √ 大小 (2)分离方法:琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺经胶电泳等。 (3)分离过程:在一定 pH 下,使蛋白质基团带上正电或负电;加入带负电荷多的 SDS,形成 “蛋白质-SDS 复合物”,使蛋白质迁移速率仅取决于分子大小。 2.实验设计 2.1 蛋白质的提取和分离一般分为哪些基本步骤? [ 样品处理、粗分离、纯化、纯度鉴定。 思考:是否所有种类的蛋白质的提取和分离都是这样的?为什么? 不是。因为蛋白质的来源和性质不同,分离方法差别很大。 2.2 选择实验材料 (1)你认为鸟类血液和哺乳动物血液中,最好哪种血液来提取血红蛋白?为什么? 哺乳动物血液。因为该细胞中没有细胞核,血红蛋白含量高。 (2)请阅读投影资料,认识哺乳动物血液组成及血红蛋白性质。并思考回答下列问题: 血液由 和 两部分组成。 血细胞中 细胞数量最多,细胞的含量最高的化合物是 。 该化合物是由 和 构成的,其中每个亚基中都含有一个能与 O2 和 CO2 结合的 基团。 2.3 从红细胞中分离出血红蛋白的过程为:洗涤红细胞、释放血红蛋白、分离血红蛋白、透 析。洗涤红细胞的目的是什么? 除去血浆蛋白的杂蛋白,有利于后续步骤的分离纯化。 红细胞的洗涤过程为 血液+柠檬酸钠→低速短时离心→吸出上层血浆→红细胞+5 倍体积生理盐水 →缓慢搅拌 10min→低速短时离心→吸出上清液→反复洗涤直至上清液无黄色 思考:加入柠檬酸钠有何目的?为什么要低速、短时离心?为什么要缓慢搅拌? 防止血液凝固;防止白细胞沉淀;防止红细胞破裂释放出血红蛋白。 思考:你有什么方法将红细胞中的血红蛋白释放出来? 加入蒸馏水,用玻璃棒快速搅拌一段时间。 补充:加入蒸馏水后红细胞液体积与原血液体积要相同。加入甲苯的目的是溶解细胞膜,有利 于血红蛋白的释放和分离。此时,红细胞破碎混合液中不仅含有血红蛋白,而且还含有细胞破碎 物、脂质、甲苯有机溶剂等。怎样除去这些杂质呢?由于它们的密度不同,科学家采取了离心分离 的方法: 红细胞破碎混合液→中速长时离心(2000c/min×10min)→滤纸过滤除去脂质→分液漏斗分离 出血红蛋白 2.4 如何除无机盐离子和小分子有机物质呢?。 透析。半透膜的选择透过性,大分子物质不能通过半透膜,离子和小分子能够通过半透膜。 在透析过程中,血红蛋白溶液中的离子和小分子不断通过半透膜扩散进入到 pH=7 的磷酸缓冲 液中。 思考:为何使用 pH=7 的磷酸缓冲液?为什么缓冲液量远多于血红蛋白溶液量? 维持血红蛋白的正常特性。有利于杂质分子充分地向外扩散。 总结:通过以上四个基本过程,红细胞中的血红蛋白就被提取出来。但其中还含有其他种类的 蛋白质分子(如呼吸酶等)。怎样将杂蛋白与血红蛋白分离开来呢?我们来研究蛋白质提取和分离 的第二个步骤――粗分离(凝胶色谱操作)。 2.5 凝胶色谱分离蛋白质包括:制作色谱柱、装填色谱柱、样品加入和 洗脱。 根据教材图 5-19,说出制作色谱柱需要的材料。 橡皮塞 2 个、打孔器、小刀、移液管、尼龙纱、尼龙网、玻璃管、尼龙管等。 色谱柱的制作过程:准备材料→加工橡皮塞→安装色谱柱 下面进行第二步―― 凝胶色谱柱的装填。请阅读教材: 色谱柱的装填过程 。 步骤 操作要求 ① ② ③ [ 操作要求 计算称量凝胶 配制悬浮液 装填悬浮 液 色谱柱垂直固定在支架上 根据色谱柱体积计算凝胶用量 凝胶颗粒+蒸馏水→充分溶胀 凝胶颗粒+洗脱液→沸水浴 一次性缓慢倒入;轻轻敲打 ④ ⑤ 缓冲液洗涤平衡 立刻用磷酸缓冲液洗涤平衡 12h 样品加入和洗脱。其基本过程是: 调节缓冲液面→加入蛋白质样品→调节缓冲液面→洗脱→收集分装蛋白质 至此,血红蛋白即可得到粗分离。在整个操作过程中,应当注意以下事项: (1)红细胞的洗涤:洗涤次数不能过少;低速、短时离心。 (2)凝胶的预处理:沸水浴法时间短,还能除去微生物和气泡 (3)色谱柱的装填:装填尽量紧密,降低颗粒间隙;无气泡;洗脱液不能断流。 (4)色谱柱成功标志:红色区带均匀一致地移动。 (三)课堂总结、点评 血 红 蛋 白 的 提 取 和 分 离 蛋白质分子的差异性 凝胶色

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